高密度发酵工艺

随着基因重组技术和发酵技术的发展，实现了菌体的低成本、规模化生产，高细胞密度发酵工艺已成为发酵领域的研究热点。

高密度细胞培养技术

又称高密度发酵技术，是指在特定的培养体系下，通过改进培养方法和培养条件，大幅度提高菌体发酵密度，最终提高产品比生产率（单位时间单位体积的产品产量）的菌体培养技术。

常用于高细胞密度培养的生物反应器类型包括普通搅拌发酵罐、具有外部或内部细胞保留装置的搅拌发酵罐、透析膜反应器、旋风反应器、气升式反应器和振动陶瓷瓶反应器。

利用高细胞密度发酵工艺具有以下优点：

• 可以提高单位体积培养液中的细菌浓度，提高体积生产率
• 相应减少反应器体积，缩短生产周期，减少设备投资
• 延长后续分离萃取时间，一定程度上减少废水量
• 降低生产成本，提高整体生产效率

高细胞密度的方法 发酵

实现高细胞密度发酵的方法主要有补料分批培养、细胞循环培养、透析培养、细胞固定化培养等，其中补料分批培养研究最为深入、应用最为广泛。

补料分批培养

补料分批培养是在分批培养的前提下，将营养物质连续或按特定模式补料到反应器中，以维持发酵系统中较低的营养物质浓度。目前，控制饲喂营养的策略主要有两种：反馈控制和非反馈控制。

采用补料分批培养可以消除碳源快速利用带来的抑制作用，避免培养过程中产生的抑制性副产物积累带来的毒性，避免快速生长带来的质粒不稳定问题的细菌。但它也有一定的缺点，例如用于反馈控制的附属设备相对昂贵，并且要求操作人员具有较高的操作技能。

C细胞循环培养

细胞循环培养采用一种方法将细胞从糊状物中分离出来，并将细胞返回到容器中进行回收。将无细胞糊状物以给定速率连续转移并用新鲜培养基替换。一般包括静置、沉降和膜过滤。

该技术可以不断地将代谢废物转移出去，避免对细胞生长的反馈抑制，并有利于目标产物的分离。

D透析培养

Dialysis culture is a method in which microorganisms are wrapped with a dialysis membrane, and fresh culture fluid flows outside. It can effectively remove harmful low molecular weight metabolites while providing sufficient nutrients to the culture solution for bacterial utilization. The semipermeable membrane is not perfused during dialysis, which avoids the membrane clogging problem in microfiltration and ultrafiltration. Moreover, the “nutrient distribution” feeding strategy is adopted to improve the nutrient utilization rate significantly.

与其他培养方法相比，透析培养可提高细胞密度30倍。利用高细胞密度的透析培养，发酵可以消除耗时的培养基优化过程，提高生产运行效率。但透析培养设备投资较大，操作技术要求较高，因此在生产中很少采用。

固定化细胞培养

细胞固定化是通过物理或化学手段将游离细胞限制或定位在特定的空间位置。利用固定化细胞可以将传统的微生物发酵转变为连续的酶促反应，提高生产率，同时减少代谢物对细胞生长的抑制作用。

乳酸菌液体核心微囊培养是细胞固定化培养的一种。它使用一层亲水性半透膜将细胞包围在珠状微胶囊中。连续培养可以在胶囊中达到非常高的浓度——细胞密度。

影响高细胞密度发酵的因素

影响高细胞密度发酵的因素很多，例如培养基的成分、溶解氧浓度、培养温度、pH值和有害代谢物。

1. 培养基组成

高细胞密度发酵一般采用半合成培养基，培养基各成分的浓度和比例必须合适，特别是碳氮比。葡萄糖是重组细菌发酵中最常用的碳源材料。然而，过高的葡萄糖浓度会抑制细胞生长，并导致代谢抑制物质乙酸积累，对细菌生长产生不利影响。

2. PH值

高细胞密度发酵过程中产生的乙酸和二氧化碳等物质会改变pH值，对细胞生长和代谢产生不利影响。在线检测方法可以用酸、碱及时调节pH值，避免pH值剧烈变化。种类。

3. 温度

Temperature changes will affect the reaction rates of various enzymes and protein properties, the fermentation broth’s physical properties, and indirectly affect the bacteria. For genetically engineered bacteria, using different temperatures at different culture stages is beneficial to increasing the growth density of the bacteria and the expression of target products and shortening the culture cycle.

4. 溶解氧浓度

For aerobic fermentation bacteria, too high or too low dissolved oxygen concentration will affect the growth and metabolism of the bacteria. Dissolved oxygen can be increased by increasing the stirring speed, increasing airflow, increasing oxygen partial pressure, using oxygen carriers, and modifying the oxygen-obtaining capacity of microorganisms. However, the higher the dissolved oxygen content, the better. It is necessary to examine each fermentation product’s critical dissolved oxygen concentration and optimal dissolved oxygen concentration and maintain the optimal dissolved oxygen concentration during the fermentation process.

5. 有害代谢物的调节

微生物高细胞密度培养过程中，二氧化碳、乙酸等代谢副产物的积累是影响细菌生长和产物表达的主要因素之一。为了降低细菌培养过程中代谢副产物的浓度，可以调整培养基的组成，特别是碳源的含量和类型，以防止抑制物质的产生。例如，如前所述，也可以使用甘油代替葡萄糖作为碳源。有望通过代谢工程改变细菌的代谢途径来阻止抑制剂的产生。

高密度发酵工艺应用

在生物制品中的应用： 研究表明，高密度发酵技术已广泛应用于利用工程菌生产各种干扰素、生长因子、天然酶、多肽、多糖等活性成分。

在食品工业中的应用： 高细胞密度发酵技术可用于培养活细胞（所需产品）。例如，通过改善培养环境和调节方法，可以获得高密度乳酸菌发酵并应用于乳制品行业。此外，高细胞密度发酵还可用于酵母生产酒精和利用螺旋藻细胞生产螺旋藻。

结论

高密度发酵技术较普通发酵技术具有独特的优势。将其应用于各种微生物产物的高效表达，可以显着降低生产成本，提高生产效率。随着科学技术的发展，高密度发酵技术将越来越多地应用于发酵生产中。

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